PCR全稱多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction），是一種非常強大的技術，可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復制DNA，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。那PCR反應準備工作要怎麼做呢?

1.PCR反應體系

10×擴增緩衝液 10μl

4種dNTP混合物（終濃度） 各100～250μmol/L

引物（終濃度） 各5～20μmol/L

模板DNA 0.1～2μg

Taq DNA聚合酶 5～10 U

Mg2+（終濃度） 1～3mmol/L

補加雙蒸水 100 μl

其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據實驗調整，以上數據僅供大致參考值。

PCR反應五要素：

引物：(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）引物有多種設計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。

酶：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據需要必須做不同的選擇。

dNTP包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP

模板：模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。

緩衝液：（其中需要Mg2+）

緩衝液的成分最為復雜，除水外一般包括四個有效成分：

緩衝體系，一般使用HEPES或MOPS緩衝體系；

一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；

二價陽離子，即鎂離子，根據反應體系確定，除特殊情況外不需調整；

輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結構。

2.PCR引物設計PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

引物設計的基本原則

引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

引物內部不應出現互補序列。

兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、di高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

3.模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、毛發等。

標本處理的基本要求是除去雜質，並部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經酚、lv仿抽提純化，再用乙醇沈澱後用作PCR反應模板。

4.反應的控制

PCR反應的緩衝液 提供合適的酸堿度與某些離子

鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L

底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L

TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）

引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L

反應溫度和循環次數

變性溫度和時間 95℃，30s

退火溫度和時間 低於引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃

延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內）

Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循環次數 ：一般為25 ～ 30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數並不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右，循環數超過30個以後，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環數的增加而增加，出現了所謂的“平臺期”

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